파워, 운명 그리고 사랑… 이젠 선택만이 남았다! 유전자 조작 거미에 물려 스파이더맨이 된 피터 파커(토비 맥과이어). 모두에겐 영웅이지만 정작 자신에겐 어려운 일 투성이다. 스파이더맨의 신분을 밝힐 수 없는 상황에서 사랑하는 메리 제인(커스틴 던스트)과의 약속은 어긋나기 일쑤고, 스파이더맨에 죽은 아버지의 복수심에 불타는 친구 해리의 모습 역시 모른 척할 수 밖에 없다. 한편 피터가 존경하는 핵물리학자 옥타비우스 교수는 실험중 사고로 기계촉수를 휘두르는 악의 화신 ‘닥터 옥토퍼스’가 된다. 이제 과학재단을 운영하는 해리가 닥터 오크에게 절실한 트리늄을 빌미로 거절못할 제안을 하면서 도시 전체가 걷잡을 수 없는 위험에 휘말리게 되는데…